Capacidade de bloqueio a patógenos de cepas de Wolbachia em Aedes sp

A bactéria Wolbachia pipientis tem sido investigada como nova estratégia de controle biológico que pode ser usada simultaneamente com as medidas de controle de vetores já existentes. O potencial desse endossimbionte para o controle de doenças trasnmitidas por vetores está na sua capacidade de induzir diversos efeitos no hospedeiro, dentre eles a capacidade de bloquear patógenos. Nos dias de hoje existem técnicas de transinfecção que permitem criar associações entre Wolbachia e hospedeiros que não abrigam a bactéria naturalmente. Estudos anteriores têm demonstrado que nesses casos o fenótipo de bloqueio é mais intenso em comparação àquele observado em mosquitos com infecção natural. As infecções nativas podem se atenuar depois de um processo de coevolução entre o hospedeiro e o endossimbionte, entretanto, sob condições específicas, possivelmente seja observada uma capacidade residual de interferência a patógenos. Uma dessas circunstâncias pode ser a carga parasitária adquirida pelo vetor em uma alimentação sanguínea. Diante do exposto, realizamos uma análise comparativa entre a capacidade de bloqueio em duas espécies de Aedes infectados com Wolbachia, o mosquito Aedes fluviatilis com a cepa natural wFlu, e o Aedes aegypti transinfectado com a cepa wMel. Mosquitos tratados com tetraciclina foram usadas como controle para cada espécie. Investigamos a capacidade de bloqueio para o Dengue vírus e para o modelo de malária aviária Plasmodium gallinaceum.

Os mosquitos foram infectados diretamente em aves com curvas ascendentes de parasitemias ou via alimentação sanguínea artificial e os intestinos foram dissecados 7 dias após infecção para contagem de oocistos. Em outra série de experimentos vírus dengue sorotipo 3 foi adicionado a sangue humano para obter titulações que variaram de 106 a 103 PFU/mLe as cargas virais foram quantificadas aos 7 e 14 dias pós infecção sanguínea por RT-qPCR.

Em contraste ao que foi observado para o P. gallinaceum,observamos diferentes respostas ao virus nas duas espécies de Aedes, a cepa wMel induziu forte interferencia a este patógeno enquanto que wFlu levou ao aumento da susceptibilidade no Ae. fluviatilis aos 7 dias pós infecção. Diante desses resultados investigamos a presença do vírus na saliva de Ae. fluviatilis. Mais uma vez foi observado aumento da susceptibilidade dos mosquitos da linhagem wFlu e detectamos a presença do virus em parte das salivas coletadas. Nossos dados sugerem que a cepa wMel não é eficiente no bloqueio do P. gallinaceum, o que indica que a capacidade de interferencia não é uma característica universal para os diferentes patógenos. Constatamos que a carga parasitária não é um fator que induz a capacidade de bloqueio em Ae fluviatilis, já que esse feito não foi observado em nenhuma das parasitemias testadas. Criticamente, demonstramos o potencial aumento da susceptibilidade de Ae. fluviatilis ao vírus dengue em uma infecção nativa de Wolbachia. Nossos resultados destacaram que a análise da capacidade de bloqueio a patógenos em mosquitos transinfectados com Wolbachia é complexa e que o estudo de espécies correlatas naturalmente infectadas por este endossimbionte podem ajudar a esclarecer questões relacionadas com o fenótipo de bloqueio de infecção a patógenos.

Avaliação da influência da Wolbachia na infecção e transmissão vertical do vírus dengue em mosquitos Aedes aegypti

A dengue é um problema médico crescente em países subtropicais e tropicais. A dengue é uma infecção viral que apresentem quatro sorotipos distintos, DENV-1 a -4, sendo recentemente relatado o quinto sorotipo, DENV-5, na Malásia. Estes são transmitidos pela picada de mosquitos infectados do gênero Aedes, sendo o Aedes aegypti o principal vetor. Atualmente, a prevenção e controle da dengue dependem exclusivamente de medidas de combate ao vetor, e estas apresentam-se ineficientes, principalmente em países em desenvolvimento. Nesse contexto, há a necessidade da busca de novas estratégias que possam ser utilizadas concomitantemente com as formas de controle já existentes. A Wolbachia é uma bactéria intracelular, amplamente conhecida por promover o fenótipo de bloqueio do vírus dengue em mosquitos A. aegypti. Apesar disto, não se conhece se a Wolbachia é capaz de interferir na infecção da progênie de mosquitos infectados com o vírus dengue, fenômeno conhecido como transmissão vertical. A transmissão vertical pode estar associada com a manutenção do vírus em períodos inter-epidêmicos ou em locais nos quais a transmissão ativa está diminuída.

Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar se a Wolbachia introduzida na linhagem brasileira de A. aegypti influencia a transmissão vertical da dengue. Duas metodologias de infecção foram utilizadas: infecção oral e nanoinjeção intratorácica, onde utilizou-se o DENV-4 e DENV-1,-3 e -4, respectivamente. Para estes experimentos, foram comparados mosquitos com Wolbachia (Mel) e uma linhagem de mosquitos tratada com antibiótico e portanto, livre da bactéria (Tet). Os ovos dos mosquitos infectados foram coletados em um período de 20 e 11 dias após a infecção, oral e injeções, respectivamente. A fecundidade e fertilidade, de forma geral, foram diminuídas na co-infecção da Wolbachia com o vírus dengue. Em todos os mosquitos infectados, não se observou diferenças na suscetibilidade ao vírus, porém a carga viral foi diminuída pela Wolbachia no DENV-4, em ambas as formas de infecção.

Foi possível a detecção de pools positivos independente da forma de infecção, demonstrando que a transmissão vertical do vírus dengue ocorreu, porém a proporção de pools positivos entre os grupos Mel e Tet não foi alterada. Entretanto, pudemos observar uma diminuição da carga viral nos pools positivos Mel. Os ovários na infecção oral, interessantemente, tiveram uma forte diminuição da suscetibilidade conferida pela Wolbachia. A carga viral dos ovários foi diminuída em DENV-1 e DENV-4, em ambas as formas de infecção. Os dados obtidos nestes experimentos apontam que a transmissão vertical do vírus dengue ocorreu em pequenas taxas. Independente da forma de infecção utilizada, as taxas não variaram, mostrando que os mecanismos que regulam a ocorrência da transmissão vertical precisam ser explorados. Concluímos que, a Wolbachia pode potencialmente ser responsável pela redução da transmissão vertical em campo. Isto é considerado um grande avanço no controle da dengue, se realmente for comprovada que a transmissão vertical é a responsável pela manutenção do vírus em períodos inter-epidêmicos.

Avaliação da influência da Wolbachia na infecção e transmissão vertical do vírus dengue em mosquitos Aedes aegypti / Evaluation of the influence of the Wolbachia infection and vertical transmission of dengue virus in Aedes aegypti mosquitoes

A dengue é um problema médico crescente em países subtropicais e tropicais. A dengue é uma infecção viral que apresentem quatro sorotipos distintos, DENV-1 a -4, sendo recentemente relatado o quinto sorotipo, DENV-5, na Malásia. Estes são transmitidos pela picada de mosquitos infectados do gênero Aedes, sendo o Aedes aegypti o principal vetor. Atualmente, a prevenção e controle da dengue dependem exclusivamente de medidas de combate ao vetor, e estas apresentam-se ineficientes, principalmente em países em desenvolvimento. Nesse contexto, há a necessidade da busca de novas estratégias que possam ser utilizadas concomitantemente com as formas de controle já existentes. A Wolbachia é uma bactéria intracelular, amplamente conhecida por promover o fenótipo de bloqueio do vírus dengue em mosquitos A. aegypti. Apesar disto, não se conhece se a Wolbachia é capaz de interferir na infecção da progênie de mosquitos infectados com o vírus dengue, fenômeno conhecido como transmissão vertical. A transmissão vertical pode estar associada com a manutenção do vírus em períodos inter-epidêmicos ou em locais nos quais a transmissão ativa está diminuída.

Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar se a Wolbachia introduzida na linhagem brasileira de A. aegypti influencia a transmissão vertical da dengue. Duas metodologias de infecção foram utilizadas: infecção oral e nanoinjeção intratorácica, onde utilizou-se o DENV-4 e DENV-1,-3 e -4, respectivamente. Para estes experimentos, foram comparados mosquitos com Wolbachia (Mel) e uma linhagem de mosquitos tratada com antibiótico e portanto, livre da bactéria (Tet). Os ovos dos mosquitos infectados foram coletados em um período de 20 e 11 dias após a infecção, oral e injeções, respectivamente. A fecundidade e fertilidade, de forma geral, foram diminuídas na co-infecção da Wolbachia com o vírus dengue. Em todos os mosquitos infectados, não se observou diferenças na suscetibilidade ao vírus, porém a carga viral foi diminuída pela Wolbachia no DENV-4, em ambas as formas de infecção.

Foi possível a detecção de pools positivos independente da forma de infecção, demonstrando que a transmissão vertical do vírus dengue ocorreu, porém a proporção de pools positivos entre os grupos Mel e Tet não foi alterada. Entretanto, pudemos observar uma diminuição da carga viral nos pools positivos Mel. Os ovários na infecção oral, interessantemente, tiveram uma forte diminuição da suscetibilidade conferida pela Wolbachia. A carga viral dos ovários foi diminuída em DENV-1 e DENV-4, em ambas as formas de infecção. Os dados obtidos nestes experimentos apontam que a transmissão vertical do vírus dengue ocorreu em pequenas taxas. Independente da forma de infecção utilizada, as taxas não variaram, mostrando que os mecanismos que regulam a ocorrência da transmissão vertical precisam ser explorados. Concluímos que, a Wolbachia pode potencialmente ser responsável pela redução da transmissão vertical em campo. Isto é considerado um grande avanço no controle da dengue, se realmente for comprovada que a transmissão vertical é a responsável pela manutenção do vírus em períodos inter-epidêmicos.

Detecção da bactéria Wolbachia em insetos através da técnica LAMP (amplificação isotérmica mediada por loop)

Wolbachia pipientis é uma bactéria intracelular que infecta cerca de 40% dos artrópodes e alguns nematódeos, causando alterações reprodutivas em seus hospedeiros. Recentemente, duas cepas de Wolbachia (wMelPop e wMel)foram inseridas individualmente em Aedes aegypti (não infectado naturalmente)e os mosquitos adultos contendo a Wolbachia foram menos suscetíveis a diferentes arboviroses (Dengue e Chikungunya) bem como ao Plasmodium sp. Atualmente, mosquitos A. aegypti contendo Wolbachia (wMel) estão sendo liberados a campo em diversos países, pelo Programa Eliminate Dengue, como possível agente de controle biológico de Dengue. Durante o processo de invasão de mosquitos contendo Wolbachia no campo, há a necessidade de realização de coletas e screening semanal de grandes quantidades de mosquitos para detecção de Wolbachia, via PCR quantitativo, técnica ainda bastante onerosa. Diante disto, é imprescindível o desenvolvimento de um método rápido, específico e de baixo custo para detecção de mosquitos infectados com a bactéria, para levantamento e monitoramento da disseminação da Wolbachia em campo. No presente trabalho, desenvolvemos com sucesso um método rápido de detecção através do LAMP (Amplificação isotérmica mediada por loop) que utiliza 3 pares de primers que se ligam em 8 regiões distintas do DNA alvo, o que torna a reação bastante específica. Em nosso caso, desenhamos iniciadores baseando-se na sequência alvo do gene 16S rRNA da bactéria. Para padronização, foram utilizados mosquitos da colônia do Insetário do Laboratório de Malária do CPqRR, infectados e não infectados por Wolbachia, além de insetos de campo (mosquitos e insetos de diferentes ordens) doados por colaboradores. O tempo de incubação estabelecido para a amplificação foi de 90 minutos à 63oC, sendo possível a realização da reação tanto em termociclador, como em banho seco.

Para análise da sensibilidade, foi feita a diluição seriada de plasmídeo contendo a sequência alvo de 109 à 100 cópias, sendo possível a amplificação utilizando apenas 1 cópia do DNA. Para verificar a especificidade, foram utilizadas amostras de diferentes espécies de bactérias e em nenhuma delas ocorreu a amplificação, confirmando que o LAMP é bastante específico. Uma maneira de reduzir os custos foi através da redução da concentração da enzima Bst DNA polimerase por reação e, com apenas 1 unidade, a amplificação ocorreu de maneira eficiente. Para visualização dos resultados, foram utilizados dois corantes, o azul de hidroxinaftol (HNB) e SYBR Green I. Em ambos foi possível diferenciar as amostras positivas das negativas sem a necessidade de géis de agarose, sendo que, com o HNB, não há manipulação de produto amplificado pois é adicionado antes da reação, o que evita possíveis contaminações, e também é possível observar a diferença de cores a olho nu, sem o uso de luz UV. Comparando os custos, em reais, para realização da técnica de PCR e LAMP, esta apresentou um custo de 53,92% menor em relação ao PCR, o que confirma ser uma técnica de baixo custo, já que não requer equipamentos sofisticados e nem eletroforese em gel de agarose para análise dos resultados.Desenvolvemos, neste trabalho, uma técnica para detecção de Wolbachia bastante especifica, rápida, sensível e de baixo custo a qual possibilita seu uso em larga escala para monitoramento de diversas espécies de insetos infectadas no campo.

Detecção da bactéria Wolbachia em insetos através da técnica LAMP (amplificação isotérmica mediada por loop) / Detection of Wolbachia bacteria in insects through the LAMP technique (isothermal amplification Loop-mediated)

Wolbachia pipientis é uma bactéria intracelular que infecta cerca de 40% dos artrópodes e alguns nematódeos, causando alterações reprodutivas em seus hospedeiros. Recentemente, duas cepas de Wolbachia (wMelPop e wMel)foram inseridas individualmente em Aedes aegypti (não infectado naturalmente)e os mosquitos adultos contendo a Wolbachia foram menos suscetíveis a diferentes arboviroses (Dengue e Chikungunya) bem como ao Plasmodium sp. Atualmente, mosquitos A. aegypti contendo Wolbachia (wMel) estão sendo liberados a campo em diversos países, pelo Programa Eliminate Dengue, como possível agente de controle biológico de Dengue. Durante o processo de invasão de mosquitos contendo Wolbachia no campo, há a necessidade de realização de coletas e screening semanal de grandes quantidades de mosquitos para detecção de Wolbachia, via PCR quantitativo, técnica ainda bastante onerosa. Diante disto, é imprescindível o desenvolvimento de um método rápido, específico e de baixo custo para detecção de mosquitos infectados com a bactéria, para levantamento e monitoramento da disseminação da Wolbachia em campo. No presente trabalho, desenvolvemos com sucesso um método rápido de detecção através do LAMP (Amplificação isotérmica mediada por loop) que utiliza 3 pares de primers que se ligam em 8 regiões distintas do DNA alvo, o que torna a reação bastante específica. Em nosso caso, desenhamos iniciadores baseando-se na sequência alvo do gene 16S rRNA da bactéria. Para padronização, foram utilizados mosquitos da colônia do Insetário do Laboratório de Malária do CPqRR, infectados e não infectados por Wolbachia, além de insetos de campo (mosquitos e insetos de diferentes ordens) doados por colaboradores. O tempo de incubação estabelecido para a amplificação foi de 90 minutos à 63oC, sendo possível a realização da reação tanto em termociclador, como em banho seco...

Para análise da sensibilidade, foi feita a diluição seriada de plasmídeo contendo a sequência alvo de 109 à 100 cópias, sendo possível a amplificação utilizando apenas 1 cópia do DNA. Para verificar a especificidade, foram utilizadas amostras de diferentes espécies de bactérias e em nenhuma delas ocorreu a amplificação, confirmando que o LAMP é bastante específico. Uma maneira de reduzir os custos foi através da redução da concentração da enzima Bst DNA polimerase por reação e, com apenas 1 unidade, a amplificação ocorreu de maneira eficiente. Para visualização dos resultados, foram utilizados dois corantes, o azul de hidroxinaftol (HNB) e SYBR Green I. Em ambos foi possível diferenciar as amostras positivas das negativas sem a necessidade de géis de agarose, sendo que, com o HNB, não há manipulação de produto amplificado pois é adicionado antes da reação, o que evita possíveis contaminações, e também é possível observar a diferença de cores a olho nu, sem o uso de luz UV. Comparando os custos, em reais, para realização da técnica de PCR e LAMP, esta apresentou um custo de 53,92% menor em relação ao PCR, o que confirma ser uma técnica de baixo custo, já que não requer equipamentos sofisticados e nem eletroforese em gel de agarose para análise dos resultados.Desenvolvemos, neste trabalho, uma técnica para detecção de Wolbachia bastante especifica, rápida, sensível e de baixo custo a qual possibilita seu uso em larga escala para monitoramento de diversas espécies de insetos infectadas no campo...